¿Cómo funciona el Western Blotting?

Western blotting es una técnica en biología molecular utilizada en la detección de una proteína específica dentro de una muestra. Utiliza SDS-PAGE para separar proteínas según su tamaño y estas proteínas separadas luego se transfieren a una membrana. Esta técnica utiliza anticuerpos primarios específicos en el etiquetado de una proteína particular en la transferencia. Los anticuerpos secundarios que están marcados con proteínas informadoras detectan las proteínas marcadas con el anticuerpo primario.

Áreas clave cubiertas

1. Que es Western Blotting
     - Definición, Hechos, Aplicaciones.
2. ¿Cómo funciona el Western Blotting?
     - Proceso de Western Blotting

Términos clave: Desarrollo del color, Membrana de nitrocelulosa, Anticuerpo primario, Anticuerpo secundario, Transferencia de Western

Que es Western Blotting

Western blotting es una técnica de hibridación utilizada en la detección de una proteína particular dentro de una muestra. También se denomina inmunotransferencia ya que la técnica utiliza anticuerpos tanto para marcar la proteína de interés como para detectar proteínas marcadas con anticuerpos..

Figura 1: Western Blot

La transferencia Western fue desarrollada por primera vez por Towbin en 1979, y actualmente se usa como una técnica de rutina para el análisis de proteínas.. 

¿Cómo funciona el Western Blotting?

La transferencia Western se usa principalmente en la detección de una proteína específica en una muestra. Los pasos de la técnica de Western Blot se describen a continuación..

1. SDS-PAGE - La muestra de proteína se separa en función de su tamaño por SDS-PAGE..
2. Transfiriendo proteínas a una membrana - Las proteínas fraccionadas por tamaño se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las técnicas involucradas en esta transferencia son la transferencia por difusión..
3. Bloqueo de sitios no específicos. - Los sitios desocupados en la membrana están bloqueados para prevenir la unión no específica de proteínas. Para este propósito se puede usar leche seca sin grasa o albúmina de suero bovino (BSA).
4. Incubación primaria de anticuerpos - La membrana bloqueada se incuba con una solución de anticuerpo primario. Estos anticuerpos primarios se unen a una proteína particular en la membrana.
5. Incubación de anticuerpos secundarios - La membrana se incuba con anticuerpos secundarios, que se unen a los anticuerpos primarios. Los anticuerpos secundarios se conjugan con proteínas informadoras. Estas proteínas informadoras pueden ser biotina, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante..
6. Detección de proteínas por desarrollo de color. - Los reporteros de enzimas conjugadas reaccionan con su sustrato para generar una fosfatasa alcalina de color que convierte BCIP en un producto de color azul, mientras que la peroxidasa de rábano picante convierte el luminol y emite luminiscencia..

Figura 2: Western Blot - Procedimiento

Conclusión

La transferencia de Western es una técnica de hibridación utilizada en la detección de la presencia de una proteína particular dentro de una muestra. Utiliza SDS-PAGE para separar proteínas según su tamaño y unión con anticuerpos primarios, que pueden ser reconocidos por anticuerpos secundarios durante el desarrollo del color..

Referencia:

1. “Principio fundamental de Western Blotting, cómo funcionan las transferencias de Western”. Boster, Disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. "Inmunoblot de ácido anti-lipoico" Por TimVickers - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. "Western Blotting" Por Cawang - Trabajo propio, CC0) a través de Commons Wikimedia