Diferencia entre PCR y RT PCR

Diferencia principal - PCR vs RT-PCR

PCR y RT-PCR son dos técnicas importantes en biología molecular. La PCR fue desarrollada por Kary Mullis en la década de 1980. Es capaz de aumentar el número de copias de un gen en particular de manera exponencial, facilitando la detección de ese fragmento de ADN en particular. Taq La polimerasa es la enzima más utilizada en los sistemas de PCR. Es una enzima termoestable. En RT-PCR, la transcripción inversa es seguida por PCR. La enzima, la transcriptasa inversa, está involucrada en la síntesis de ADN complementario a partir de ARN. los diferencia principal entre PCR y RT-PCR es que La PCR utiliza el ADN de doble cadena como plantilla, mientras que la RT-PCR utiliza el ARN como plantilla.

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es la PCR?
      - Definición, Proceso, Aplicación
2. ¿Qué es RT PCR?
      - Definición, Características, Aplicación.
3. ¿Cuál es la diferencia entre PCR y RT PCR?
      - Comparación de diferencias clave

Términos clave: PCR, RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa, plantilla de ADN, polimerasa de ADN, desnaturalización, recocido, extensión del cebador

¿Qué es la PCR?

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) es un método relativamente simple pero revolucionario. La PCR utiliza la capacidad de la enzima, la ADN polimerasa para sintetizar nuevas cadenas de ADN de manera complementaria a la línea de la plantilla ofrecida. La PCR es una técnica indispensable utilizada en los laboratorios clínicos y de investigación para el análisis funcional de genes, el diagnóstico y el monitoreo de enfermedades hereditarias, la clonación de ADN, la secuenciación y la amplificación de ADN antigua. La plantilla de ADN, los nucleótidos, los cebadores y la polimerasa de ADN son los cuatro componentes principales de la PCR. los Plantilla de ADN suele ser un ADN de doble cadena con la secuencia diana, que debe amplificarse. Taq ADN polimerasa que está aislado de Termos acuaticos Se usa comúnmente en la PCR. los Pfu ADN polimerasa Es otro tipo de ADN polimerasa con alta fidelidad. Ambos Taq y Pfu Las polimerasas son resistentes al calor. Los nucleótidos agregados por las ADN polimerasas son adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Dado que la ADN polimerasa solo puede agregar un nuevo nucleótido en un extremo 3 'de una cadena de ADN preexistente, se requiere un cebador oligonucleótido para el inicio de la síntesis de ADN. El requisito de un cebador en la PCR permite delinear solo una región específica en la plantilla. La secuencia de destino está flanqueada por cebadores directos e inversos. Al final de una PCR, las nuevas copias llamadas amplicones de una secuencia específica de ADN se acumulan en miles de millones. Los componentes de la PCR deben optimizarse de tal manera que mejoren el rendimiento de la PCR y minimicen las fallas..

La PCR es un proceso automatizado realizado por termocicladores, que son capaces de cambiar entre diferentes temperaturas. PCR es un proceso de tres pasos.

Desnaturalización - La plantilla de ADN de doble cadena se separa en dos cadenas simples calentando a 94-95 ° C.
Recocido - Los cebadores directo e inverso se unen a las secuencias complementarias en la plantilla. La temperatura de este paso depende de la temperatura de fusión de la combinación de imprimación..
Extensión de imprimación - La enzima ADN polimerasa extiende cada uno de los cebadores en su extremo 3 agregando bases complementarias a la cadena en crecimiento. La temperatura óptima de Taq La polimerasa, 72 ° C se usa como la temperatura en la etapa de extensión. El tiempo de la extensión depende del número de pares de bases en la línea de la plantilla.

Los tres pasos se repiten por 28-35 veces..

Figura 1: Reacción en cadena de la polimerasa

Los productos de la PCR se fraccionan por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa en comparación con una escalera de ADN. La visualización del ADN en un gel de agarosa se realiza mediante tinción con bromuro de etidio y observación bajo UV. Las bandas de ADN amplificadas bajo UV en un gel teñido con bromuro de etidio se muestran en Figura 2. La escalera de ADN se muestra en el pozo más a la izquierda..

Figura 2: bandas de ADN

Qué es RT-PCR

RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa) es una de las técnicas más sensibles utilizadas para la detección de ARNm. El ARN es la plantilla adecuada para recopilar información sobre la expresión génica de un tejido normal o la expresión génica de un tejido infectado. La plantilla para la RT-PCR puede ser ARN total o ARN viral o bacteriano respectivamente. El ARN se transcribe a la inversa en ADN complementario (ADNc) por la enzima, la transcriptasa inversa. La temperatura óptima de la transcriptasa inversa es de 46 ° C. El cDNA se utiliza en la PCR para obtener el producto. Los pasos en la PCR de transcripción inversa se muestran en figura 3.

Figura 3: RT-PCR

La RT-PCR se puede realizar en reacciones de dos o uno pasos. En la reacción de dos pasos, la transcripción inversa y la PCR se realizan en dos pasos separados. En la RT-PCR de un solo paso, la transcripción inversa es seguida por la PCR en un solo tubo de manera secuencial. Tanto el ADNc como el producto final de la PCR se pueden ejecutar en un gel de agarosa para los propósitos de fraccionamiento por tamaño y visualización. RT-PCR de uno y dos pasos se muestran en Figura 4.

Figura 4: RT-PCR de un paso y dos pasos

Diferencia entre PCR y RT-PCR

Definición

PCR: La PCR es una técnica utilizada en biología molecular para amplificar un segmento de ADN que genera millones de copias de una secuencia de ADN..

RT-PCR: RT-PCR es una variante de la PCR utilizada en la detección de la expresión génica en biología molecular.

Pasos

PCR: La desnaturalización, el recocido y la extensión son los tres pasos en la PCR.

RT-PCR: En RT-PCR, la transcripción inversa es seguida por PCR.

Modelo

PCR: Una molécula de ADN de doble cadena sirve como plantilla para la PCR.

RT-PCR: Una molécula de ARN monocatenario sirve como plantilla para la transcripción inversa. Una molécula de ADN de una sola hebra sirve como plantilla para la PCR.

Enzimas utilizadas

PCR: La ADN polimerasa se usa como la enzima en la PCR.

RT-PCR: La transcriptasa inversa y la ADN polimerasa se utilizan como enzimas en la RT-PCR.

Imprimaciones

PCR: Los cebadores directos e inversos se utilizan en la PCR.

RT-PCR: Solo se utiliza el cebador inverso para la transcripción inversa y se utilizan los cebadores directo e inverso en la PCR.

Sensibilidad

PCR: PCR es un método sensible.

RT-PCR: RT-PCR es más sensible que la PCR.

Aplicaciones

PCR: La PCR se utiliza en el análisis funcional de genes, el diagnóstico y el monitoreo de enfermedades hereditarias, la clonación de ADN, la secuenciación de ADN y la amplificación de ADN antigua..

RT-PCR: RT-PCR se utiliza en la detección de la expresión génica..

Conclusión

PCR y RT-PCR son dos de las técnicas importantes utilizadas en biología molecular. Tanto la PCR como la RT-PCR son técnicas automatizadas capaces de aumentar exponencialmente el número de copias de una secuencia de ADN diana, que se define mediante los cebadores directo e inverso. En la PCR, el ADN de doble cadena se utiliza como plantilla. Por PCR, se puede realizar la clonación de ADN, la secuenciación de ADN y el análisis funcional de los genes. En la RT-PCR, la expresión génica en un tejido particular puede observarse amplificando el ARN. La principal diferencia entre la PCR y la RT-PCR está en sus plantillas utilizadas en cada reacción y en sus aplicaciones..

Referencia:

1. "Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)". Centro Nacional de Información Biotecnológica. Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos, n.d. Web. Disponible aquí. 01 de junio de 2017.
2. "Reacción en cadena de la polimerasa (o PCR)". Clonación y análisis molecular de genes. N.p., n.d. Web. Disponible aquí. 01 de junio de 2017.
3. Biolabs, Nueva Inglaterra. “Síntesis de CDNA y RT-PCR”. Síntesis de CDNA y RT-PCR | NEBRASKA. N.p., n.d. Web. Disponible aquí. 01 de junio de 2017.

Imagen de cortesía:

1. "Reacción en cadena de la polimerasa" Por Enzoklop - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis". Por Rainis Venta - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia.
3. “Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa” Por Jpark623 - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
4. “RT-PCR de un paso frente a dos pasos” por Jpark623 - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia

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