Cómo hacer una línea de células transfectadas estables

La transfección estable es la introducción a largo plazo de ADN extraño en las células. Las células transfectadas establemente pasan el ADN extraño a través de la progenie. Por lo tanto, para hacer líneas celulares transfectadas de manera estable, el ADN extraño debe integrarse en el genoma de la línea celular. Sin embargo, también se puede observar una herencia estable en el ADN no genómico. Una transfección estable y exitosa requiere métodos efectivos de entrega de ADN así como métodos de selección para ADN extraño dentro de la línea celular. Las líneas celulares transfectadas de manera estable se utilizan para una amplia gama de aplicaciones, como la producción de proteínas recombinantes, estudios de función de genes, ensayos de descubrimiento de fármacos, etc..

Áreas clave cubiertas

1. Cómo hacer una línea de células transfectadas estables
      - Protocolo de generación de línea celular estable
2. Cómo seleccionar el ADN transfectado en la línea celular
     - Selección de la línea celular establemente transfectada

Términos clave: mantenimiento episomal, integración en el genoma, plásmido, selección, líneas celulares establemente transfectadas

Cómo hacer una línea de células transfectadas estables

La transfección es un método de transferencia de genes en el que el material genético se introduce deliberadamente en la célula huésped mediante métodos químicos o no químicos. Hay dos tipos de líneas celulares transfectadas establemente:

1. El tipo principal de líneas celulares estables se genera por la integración directa del ADN transfectado en el genoma del organismo huésped. El ADN transfectado se integra en el genoma por recombinación homóloga.
2. El otro método para generar líneas celulares estables es el mantenimiento episomal del ADN transfectado. Los vectores eucariotas se utilizan en la transfección de ADN que no están integrados en el genoma. Sin embargo, la estabilidad del ADN episomal es baja. Además, los episomas solo son mantenidos por ciertos tipos de especies. Las líneas celulares establemente transfectadas se muestran en Figura 1.

Figura 1: Líneas celulares establemente transfectadas

Proceso

Los pasos involucrados en la generación de líneas celulares estables se describen a continuación..

1. Generación de una curva de destrucción que determina la concentración óptima de antibióticos de selección: las células se someten a cantidades crecientes de concentración de antibióticos para determinar la concentración mínima de antibióticos requerida para matar todas las células durante una semana.
2. Transfección de células con el plásmido deseado. El método de transfección difiere según el tipo de células huésped. Los reactivos liposómicos se utilizan en la transfección de líneas celulares adherentes. La electrotransfección o los métodos virales se utilizan para transfectar líneas celulares en suspensión..
3. Selección y expansión de colonias policlonales estables: a las 48-72 horas de transfección, se agregan a los cultivos concentraciones altas, óptimas y bajas de antibióticos selectivos para obtener las líneas celulares transfectadas de manera estable.

Cómo seleccionar el ADN transfectado en líneas celulares

Los marcadores de selección se expresan conjuntamente con el ADN transfectado para la selección de células transfectadas con éxito. El gen marcador podría estar en el mismo vector (cis) utilizado para transfectar la célula huésped o en otro vector (trans). La resistencia a los antibióticos como neomicina, zeocina, higromicina, puromicina, DHFR, etc. se puede utilizar en la selección. Además, los genes transfectados se pueden marcar con GFP..

Conclusión

Las líneas celulares estables se pueden hacer principalmente mediante la integración de ADN transfectado en el genoma. Además, el mantenimiento episómico del ADN transfectado también se puede usar para hacer líneas celulares estables durante un largo período de tiempo en algunos organismos huésped. Debería existir un método de selección para la identificación del ADN transfectado en la línea celular.. 

Referencia:

1. “Protocolo de generación de línea celular estable”. Creative BioMart, Disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. "Knockout mouse production 2" Por Kjaergaard - Trabajo propio (CC BY 3.0) a través de Commons Wikimedia