Cómo hacer imprimaciones para PCR

Los cebadores son un componente esencial en la amplificación del ADN tanto en vivo y in vitro. En vivo, la enzima, la ADN polimerasa requiere un cebador para el inicio de la replicación del ADN. In vitro, Los cebadores se utilizan principalmente para el inicio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Algunas otras técnicas, como la secuenciación, la clonación, la mutagénesis dirigida al sitio, etc. requieren cebadores. De ahí, el diseño de primers para in vitro Las técnicas se vuelven bastante simples pero, un proceso desafiante para los biólogos moleculares. Por lo tanto, las reglas básicas para el diseño de cebadores para PCR y secuenciación se analizan en este artículo..

Áreas clave cubiertas

1. Que es un Primer
- Definición, Tipos, Rol
2. ¿Cómo funcionan los cebadores en una PCR?
- Características del ADN, Proceso de PCR.
3. Cómo hacer imprimaciones para PCR
- Reglas básicas para diseñar cebadores de PCR
4. Cómo diseñar una cartilla de secuenciación
- Características de los cebadores de secuenciación

Términos clave: Síntesis de ADN, Cebadores directos, Longitud, Temperatura de fusión, PCR, Cebadores inversos, Cebadores de secuenciación

Que es un Primer

Un cebador es una cadena corta de ADN o ARN que sirve como punto de partida para la síntesis de ADN. Las enzimas que catalizan la replicación del ADN son capaces de agregar nucleótidos a un extremo 3 'existente. Por lo tanto, el cebador sienta las bases para la síntesis de ADN sirviendo como un primer. Cebadores de ARN Se utilizan dentro de la célula para el inicio de la replicación del ADN por la ADN polimerasa. Sin embargo, sintético Cebadores de ADN Se puede utilizar para la amplificación de ADN, principalmente mediante PCR y otras técnicas. Se utilizan dos tipos de cebadores en la PCR, y se conocen como cebadores directos e inversos. Durante la PCR, se pueden producir millones de copias del fragmento de ADN deseado flanqueando esa secuencia de ADN particular en el ADN genómico mediante cebadores directos e inversos. El cebador directo e inverso que flanquea una secuencia de ADN particular se muestra en Figura 1.

Figura 1: Cebadores directos e inversos

¿Cómo funcionan los cebadores en la PCR?

El ADN es una molécula que tiene dos hebras que se mantienen juntas. El patrón de pares de bases es complementario a cada uno en ambas cadenas. Las dos cadenas se mantienen unidas por los enlaces de hidrógeno entre las bases de nitrógeno complementarias. Además, cada hebra tiene su propia direccionalidad. Una hebra tiene una direccionalidad de 5 'a 3', mientras que la otra tiene una direccionalidad de 3 'a 5'. Por lo tanto, las dos hebras son antiparalelas. La hebra con dirección 5 'a 3' se conoce como hebra con sentido, mientras que la hebra con dirección 3 'a 5' se conoce como hebra antisentido. Cada dos cadenas debe sintetizarse individualmente durante la PCR.

Los tres pasos de la PCR son la desnaturalización, el recocido y la elongación. En la desnaturalización, las dos cadenas de ADN se separan rompiendo los enlaces de hidrógeno calentando a 95 ° C. El cebador directo se une a la cadena con sentido, mientras que el cebador inverso se une a la cadena antisentido. El recocido de los cebadores ocurre cuando la temperatura desciende de 95 ° C a 50-60 ° C. Por lo tanto, ambas cadenas se pueden sintetizar al mismo tiempo con la ayuda de Taq polimerasa La amplificación de ambos hilos sentido y antisentido ocurre en la dirección 5 'a 3'. Como la PCR es una reacción exponencial, los tres pasos se repiten en 25-35 ciclos. En cada ciclo se utilizan cebadores directos e inversos para producir alrededor de 2³⁵ Copias del fragmento de ADN deseado. El papel de los cebadores en la PCR se muestra en Figura 2.

Figura 2: PCR

Cómo hacer imprimaciones para PCR

Con el fin de amplificar un fragmento de ADN particular en el genoma, ese fragmento de ADN particular debe estar flanqueado por cebadores directos e inversos. Por lo tanto, ambos cebadores deben ser complementarios a las secuencias que flanquean el fragmento de ADN. Las pautas básicas para el diseño exitoso de los cebadores de PCR se describen a continuación..

La dirección del cebador directo e inverso debe ser de 5 'a 3'.
La longitud de cada cebador debe estar entre 18 y 25 nucleótidos de longitud..
El contenido de GC de los cebadores está entre el 40 y el 60% y la presencia de una C o G en el extremo 3 'del cebador puede promover la unión.
La temperatura de fusión y la Tm (la temperatura a la que la mitad del cebador se ha recocido con la plantilla) del par de cebadores debe ser similar y superior a 60 ° C. La diferencia máxima debe ser de 5 ° C..
El extremo 3 'del cebador debe coincidir exactamente con la plantilla del ADN..
Al menos 2G o C bases (pinza GC) deben estar presentes en las últimas 5 bases en el extremo 3 'del cebador. La pinza GC promueve una fuerte unión a la secuencia objetivo.
Los sitios de restricción con 5-6 nucleótidos se pueden agregar al extremo 5 'del cebador.
Las repeticiones de dinucleótidos (ATATATAT) o repeticiones del mismo nucleótido más de 4 veces (ACCCC) deben evitarse en las secuencias de cebadores. Esto causa errores de imprenta.
Debe evitarse la homología intra-cebador o las estructuras secundarias de los cebadores. Debe evitarse la homología entre cebadores o las secuencias complementarias en los cebadores directo e inverso. Ambas condiciones pueden formar auto-dímeros o cebadores-dímeros..
El valor de ΔG para el análisis de dímeros debe estar entre 0 y −9 kcal / mol.

Muchas herramientas en línea están disponibles para facilitar el diseño del cebador, como Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. La especificidad de los cebadores diseñados puede ser determinada por herramientas tales como NCBI Primer-BLAST o UCSC in-silico PCR..

Figura 3: Interfaz Primer 3

Cómo diseñar una cartilla de secuenciación

Los cebadores de secuenciación son cortos, las cadenas de ADN, al igual que los cebadores de PCR. Sin embargo, los cebadores de PCR están diseñados para la amplificación de un fragmento de ADN particular, mientras que los cebadores de secuenciación se usan para revelar la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN amplificado por PCR. A diferencia de los cebadores de PCR, se puede usar un solo cebador en la secuenciación, si solo la secuencia objetivo tiene una longitud inferior a 500 pb. Como ejemplo, el cebador directo de la PCR se puede usar en la secuenciación, para amplificar solo la cadena de sentido. Además, el grado de desajustes tolerados durante la reacción de secuenciación es mayor que el de la PCR. En general, los cebadores de PCR son complementarios a la secuencia diana. Sin embargo, algunos cebadores de secuencia no están relacionados con la secuencia objetivo. Son conocidos como primers universales. Los cebadores universales, como T7 o SP6, hacen un recocido al vector que transporta la secuencia objetivo. Se pueden usar tanto para una variedad de vectores como para varios tipos de fragmentos de ADN..

Conclusión

Los cebadores se utilizan en la PCR y en la secuenciación para el inicio de la síntesis de ADN. Dos tipos de cebadores de PCR se pueden identificar como cebadores directos e inversos. Los cebadores directos se hibridan con la hebra sensora, mientras que los cebadores inversos se hibridan con la hebra antisentido. En la secuenciación, se puede usar un cebador directo o inverso para amplificar el objetivo. Durante el diseño de los cebadores, deben considerarse muchos factores, como la longitud del cebador, la Tm y el contenido de GC. Hay muchas herramientas en línea disponibles que se pueden usar para diseñar cebadores para una secuencia particular.

Referencia:

1. “Diseño de imprimación: consejos para un proceso eficiente”. Genome Compiler Corporation, 3 de noviembre de 2015, disponible aquí.
2. “Diseño de cebadores y cebadores de secuenciación”. Diseño de cebadores y cebadores de secuenciación, Universidad de Calgary, disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. “Primers RevComp” por Zephyris - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. “Reacción en cadena de la polimerasa” Por Enzoklop - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia

Ciencia