Cómo diseñar cebadores para mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio (SDM) es una in vitro Método de creación de una mutación en una secuencia conocida. A menudo se realiza mediante métodos basados ​​en PCR. Típicamente, una o dos bases se cambian en la mutagénesis dirigida al sitio. Los cebadores pueden diseñarse con las mutaciones deseadas para introducir pequeños cambios en la secuencia de nucleótidos. La extensión del cebador y la PCR inversa se pueden usar para introducir mutaciones a gran escala. Este enfoque puede cambiar la composición de aminoácidos de una proteína particular. La mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para estudiar los cambios de la actividad de las proteínas. También se utiliza para crear proteínas de fusión, así.

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es la mutagénesis dirigida al sitio (SDM)?
      - Definición, Rol, Método
2. Cómo diseñar cebadores para mutagénesis dirigida al sitio
     - Sustituciones, Eliminaciones, Inserciones

Términos clave: eliminaciones, inserciones, mutaciones, mutagénesis dirigida, sustituciones, PCR tradicional

¿Qué es la mutagénesis dirigida al sitio?

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica de biología molecular utilizada para introducir cambios específicos en una secuencia de nucleótidos de un gen. Se utiliza para cambiar la secuencia de aminoácidos de una proteína, introducir o eliminar sitios de restricción, destruir sitios de unión a la transcripción y crear proteínas de fusión..

Proceso

Durante la mutagénesis dirigida al sitio, las mutaciones se introducen en los plásmidos utilizando cebadores, que consisten en la mutación deseada. Toda la plantilla se amplifica por PCR, incorporando la mutación en la plantilla. Luego, la plantilla principal se elimina de la muestra con el uso de una enzima, la endonucleasa dependiente de la metilación. El producto de PCR o la molécula de plásmido cortada con la mutación deseada se transforma en bacterias. Los plásmidos se pueden aislar de las bacterias con las modificaciones deseadas. El proceso de mutagénesis dirigida al sitio se muestra en Figura 1.

Figura 1: mutagénesis dirigida al sitio

Se utilizan tres tipos principales de métodos para introducir mutaciones deseadas en la mutagénesis dirigida al sitio. Son PCR tradicionales, extensión de cebadores y PCR inversa. La extensión del cebador y la PCR inversa se pueden usar para introducir cambios de nucleótidos a gran escala.

PCR tradicional

La PCR tradicional se puede usar para introducir uno o dos cambios de nucleótidos en la secuencia objetivo con cebadores modificados. Los cambios pueden ser sustituciones de nucleótidos, eliminaciones o adiciones. La mutación se incorpora en el amplicón durante la PCR. Por lo tanto, la secuencia original se reemplaza por la secuencia mutada en el cebador.

Extensión de imprimación

En la extensión del cebador, la mutación deseada se incorpora durante una PCR anidada. Aquí, la secuencia objetivo está flanqueada por dos cebadores. La mutación deseada se incorpora en el cebador interno y, la mutación se introduce en la segunda ronda de PCR. En general, la especificidad de una reacción de PCR disminuye con el aumento del número de nucleótidos no coincidentes en los cebadores. Sin embargo, pueden usarse cebadores internos largos con mutaciones a gran escala en la extensión del cebador, ya que la PCR anidada puede aumentar la especificidad de la reacción de PCR.

PCR inversa

La PCR inversa es un método para amplificar fragmentos de ADN desconocidos mediante el diseño de cebadores para una secuencia de ADN conocida. Se puede utilizar para sustituir, eliminar o insertar nucleótidos en.

Las aplicaciones de la mutagénesis dirigida al sitio se describen a continuación..

1. Estudiar la estructura, función y propiedades catalíticas de las proteínas.
2. Mejorar las propiedades de las proteínas (ingeniería de proteínas).
3. Introducir o eliminar sitios de endonucleasas de restricción..

Cómo diseñar cebadores para mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio es un proceso de introducción de la mutación deseada mediante un cebador. La mutación puede ser una sustitución, inserción o eliminación. A medida que la especificidad de la PCR disminuye con el aumento de nucleótidos no coincidentes en el cebador, la PCR tradicional solo puede introducir uno o dos cambios de pares de bases en la secuencia objetivo. Se pueden usar otros métodos, como la extensión del cebador y la PCR inversa, para introducir mutaciones a gran escala. El diseño del cebador en la mutagénesis dirigida al sitio se muestra en Figura 2.

Figura 2: Cebadores para mutagénesis dirigida al sitio

Sustitución

Para las sustituciones, uno de los dos cebadores debe contener la mutación deseada en el medio del cebador. Aquí, el sitio que contiene la mutación no se adapta a la secuencia de destino, ya que forma una distorsión.

Supresión

Para las eliminaciones, la secuencia que se eliminará del objetivo se puede ignorar durante el diseño del cebador. Como esta secuencia está situada aparte de la región flanqueada por los cebadores, no se amplificará durante la PCR.

Inserción

Para las inserciones, la secuencia que se agrega se enreda en el extremo 5 'de uno de los cebadores durante el diseño del cebador. Por lo tanto, la secuencia insertada puede permanecer unida al amplicón también.

Conclusión

La mutagénesis dirigida al sitio es una técnica utilizada para introducir mutaciones en una secuencia de ADN. Estas mutaciones pueden ser sustituciones, inserciones o eliminaciones. Se pueden introducir mutaciones a pequeña escala en la PCR tradicional. Se pueden introducir mutaciones a gran escala en la extensión del cebador o PCR inversa. La introducción de la mutación se realiza mediante la incorporación de la mutación deseada al cebador.. 

Referencia:

1. "Métodos para la mutagénesis dirigida al sitio". TECNOLOGÍAS DE ADN INTEGRADO, Disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. “Mutagénesis dirigida al sitio” por Knbusby: trabajo propio (dominio público) a través de Commons Wikimedia