Cómo diseñar cebadores para QPCR

La PCR cuantitativa o en tiempo real se utiliza como un ensayo de rutina para monitorear los cambios relativos en la expresión génica en diferentes condiciones experimentales. El diseño de cebadores y sondas durante la QPCR es uno de los factores más importantes que afectan la calidad y el éxito del ensayo. Se aplican varias pautas para el diseño de cebadores para QPCR: el contenido de GC de los cebadores debe ser del 35-65%; la temperatura de fusión de los cebadores debe estar dentro de 60-68 ° C; También se deben evitar las estructuras secundarias, las repeticiones de Gs o Cs que son más largas que 3 bases, y la formación de dímeros de cebadores..

Áreas clave cubiertas

1. Qué es QPCR
      - Definición, Proceso, Usos
2. Cómo diseñar cebadores para QPCR
     - Pautas para el diseño de imprimación para QPCR

Términos clave: Colorantes fluorescentes, Contenido de GC, Temperatura de fusión, Imprimaciones, PCR cuantitativa (QPCR)

Qué es QPCR

QPCR es un tipo de PCR que permite la cuantificación del producto en tiempo real. Los tintes fluorescentes se pueden usar en la cuantificación de los productos de PCR al etiquetarlos en cada paso. Se pueden usar dos métodos de etiquetado fluorescente en los ensayos de QPCR. Son el uso de tintes fluorescentes y las sondas marcadas con fluorescencia. Los tintes fluorescentes se unen al producto de la PCR mientras que las sondas se hibridan con el producto de la PCR para formar un ADN tríplex estable. El colorante fluorescente ampliamente utilizado en QPCCR es SYBR Green, mientras que las sondas pueden ser Taqman. El uso de sondas en la detección de productos de PCR durante la QPCR proporciona resultados más precisos y aumenta la sensibilidad del ensayo.

Figura 1: Mecanismo de QPCR

Cómo diseñar cebadores para QPCR

El diseño de cebadores para QPCR es crucial para aumentar la confiabilidad, la precisión y la sensibilidad del ensayo. A continuación se describen las pautas para el diseño de cebadores QPCR..

1. Producto de PCR / Tamaño del amplicón: el tamaño del producto de PCR debe ser de 50-210 pares de bases de tamaño.
2. Longitud del cebador: la longitud de los cebadores debe ser de 19 a 23 nucleótidos.
3. Contenido de GC: el contenido de GC de los cebadores debe ser del 35-65%..
4. Temperatura de fusión (Tm): la temperatura de fusión de los cebadores debe ser de 60-68 ° C. La temperatura de recocido para el ensayo es 5 ° C menor que la Tm de los cebadores..
5. Unión exón-exón: cuando se amplifica el ADNc por QPCR, los cebadores deben abarcar la unión exón-exón para evitar la amplificación del ADN contaminante..
6. Repeticiones y ejecuciones: se deben evitar las repeticiones de dinucleótidos (TCTCTCTCTC) y los nucleótidos repetidos (por ejemplo, TAAAAAAAGC).
7. Complementariedad 3 ': deben evitarse las regiones complementarias de los extremos 3' de los cebadores directo e inverso para evitar la formación de dímeros de cebadores.
8. Estabilidad de 3 ': deben incluirse residuos G o C en el extremo 3' del cebador para aumentar la estabilidad del recocido.
9. Pinza GC: una o dos pinzas GC en el extremo 5 'del cebador aumentan la especificidad del recocido.
10. Especificidad: BLAST debe verificar la especificidad de los cebadores.
11. SNP: los cebadores no deben contener ninguna variación conocida de SNP (polimorfismo de nucleótido único)

Se pueden usar varias herramientas en línea en el diseño de imprimación en QPCR, como Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank y OAT.

Figura 2: Formación de cebadores-dímeros.

Los cebadores deben diseñarse de tal manera que eviten la formación de cebadores-dímeros en la QPCR. Es crítico cuando se usan tintes fluorescentes para la detección del producto de PCR ya que estos tintes también se unen con los dímeros de cebador para dar resultados positivos falsos.

Conclusión

QPCR se utiliza en la detección y cuantificación de productos de PCR. El diseño de cebadores es crucial en QPCR para aumentar la precisión de los resultados. Por lo tanto, es importante seguir cuidadosamente las pautas para diseñar cebadores para QPCR.

Referencia:

1. “Diseño y optimización de ensayos de QPCR”. LSR | Bio-Rad, disponible aquí.

Imagen de cortesía:

 

1. "Taqman" por usuario: Braindamaged - Trabajo propio del cargador original (dominio público) a través de Commons Wikimedia
2. “Formación de dímeros de cebadores En” Por Tzachi Bar - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia