Cómo calcular la eficiencia de la transfección

La eficiencia de la transfección se puede calcular contando el número de células transfectadas sobre el total de células en una muestra particular. El número de celdas puede ser contado por dos métodos. El método más utilizado es usar reporteros fácilmente manejables. Estos informadores pueden ser proteínas de fluorescencia verde (GFP), luciferasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina secretada (SEAP). El método más reciente para calcular la eficiencia de la transfección es marcar los ácidos nucleicos, lo que permite realizar un seguimiento de la administración intracelular de los mismos. Algunos otros enfoques, como la transferencia de Western, la inmunotinción y los ensayos funcionales también se pueden usar para calcular la eficacia de la transfección. Dado que la eficiencia de la transfección depende de múltiples parámetros experimentales, la determinación de la eficiencia de la transfección es la clave para determinar la influencia de varios factores en la transfección..

Áreas clave cubiertas

1. ¿Cuáles son los métodos utilizados para calcular la eficiencia de la transfección?
     - Sistemas de reportero
2. Cómo calcular la eficiencia de la transfección
     - Conteo celular

Términos clave: citometría de flujo, GFP, etiquetado de ácido nucleico, sistema de informe, eficiencia de transfección

¿Cuáles son los métodos utilizados para calcular la eficiencia de la transfección?

Se utilizan diferentes tipos de métodos para calcular la eficiencia de la transfección..

1. Sistemas informadores

- Proteína de fluorescencia verde (GFP) - GFP se encuentra naturalmente en las medusas. Se utiliza para el análisis cualitativo y cuantitativo de células transfectadas mediante la transfección simultánea del gen GFP con el gen de interés. El análisis cualitativo se puede hacer bajo un microscopio de fluorescencia. El análisis cuantitativo se puede realizar mediante citometría de flujo. Además de GFP, la proteína de fluorescencia roja (RFP) y la proteína de fluorescencia amarilla (YFP) también pueden usarse como informadores. E. coli Las colonias que expresan proteínas fluorescentes se muestran en Figura 1.

Figura 1: Proteínas Fluorescentes

• Luciferasa - La luciferasa se encuentra naturalmente en las luciérnagas, generando luz. Los ensayos de luciferasa son muy sensibles y pueden usarse para el análisis cuantitativo de ADN transfectado.
• Beta-galactosidasa - La beta-galactosidasa se encuentra en E. coli. Se utiliza en el análisis cualitativo realizado con X-gal y el análisis cuantitativo realizado mediante métodos colorimétricos, fluorescentes o quimioluminiscentes..
• Fosfatasa alcalina secretada (SEAP) - SEAP es un informador estable al calor, que se secreta a partir de células de mamíferos cuando se expresa.

2. Etiquetado de ácidos nucleicos - Los plásmidos marcados por fluorescencia se pueden usar en la transfección. Luego se pueden contar bajo un microscopio de fluorescencia..

3. Western blotting, inmunotinción y otros ensayos funcionales

Cómo calcular la eficiencia de la transfección

El número de células que muestran el indicador y el número de células que no muestran el indicador se pueden contar con un microscopio o mediante citometría de flujo. El porcentaje de células que exhiben el reportero da la eficiencia de transfección..

Figura 2: Eficiencia de transfección

Conclusión

La eficiencia de la transfección se puede calcular determinando el número de células que exhiben ADN transfectado sobre el número total de células en la muestra. El número de células se puede calcular bajo el microscopio o por citometría de flujo utilizando un sistema informador.

Referencia:

1. "Medir la eficiencia de la transfección". Mirus Bio LLC, Disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. “E. Coli que expresa proteínas fluorescentes "Por Erin Rod - Trabajo propio, (CC BY-SA 4.0) a través de Commons Wikimedia