¿Cómo ayudan los marcadores fluorescentes a determinar una secuencia de nucleótidos?

La secuenciación del ADN es una técnica que ayuda a determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN particular. Los dos métodos de secuenciación son la secuenciación de Sanger y la secuenciación de próxima generación. Ambos tipos de métodos de secuenciación están completamente automatizados y actualizados. Cualquier cadena de ADN está compuesta por los cuatro nucleótidos: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Los nucleótidos en el fragmento de ADN están marcados con cuatro marcadores fluorescentes separados en ambos tipos de métodos de secuenciación. Los marcadores fluorescentes o fluoróforos son moléculas capaces de absorber la luz y emitirla en una longitud de onda bien definida. Los marcadores fluorescentes se incorporan en la cadena de ADN mediante PCR. Luego la secuencia de los nucleótidos es determinada por técnicas automatizadas..

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es la secuenciación?
     - Definición, Secuenciación Sanger, Secuenciación De Próxima Generación
2. ¿Cómo ayudan los marcadores fluorescentes a determinar una secuencia de nucleótidos?
     - Procedimiento de secuenciación

Términos clave: Dideoxinucleótidos (ddNTP), Marcador fluorescente, Electroforesis en gel, Secuenciación de próxima generación, Secuencia de nucleótidos, PCR, Secuenciación de Sanger

¿Qué es la secuenciación?

La secuenciación es una técnica de laboratorio utilizada para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN. Dos tipos principales de métodos de secuenciación de ADN pueden identificarse como la secuenciación de Sanger y la secuenciación de la próxima generación. Tanto la secuenciación de Sanger como la secuenciación de próxima generación utilizan nucleótidos marcados con fluorescencia para la determinación de la secuencia de nucleótidos.

Secuenciación Sanger

La secuenciación de Sanger es el primer método desarrollado de secuenciación de ADN. El método de secuenciación fue desarrollado por primera vez por Fredric Sanger en 1975. En consecuencia, se conoce como secuenciación de Sanger. El método de secuenciación de Sanger también se conoce como método de terminación de cadena ya que está involucrado en la incorporación selectiva de dideoxinucleótidos de terminación de cadena (ddNTPS) por la ADN polimerasa durante in vitro Síntesis de ADN. La elongación de la cadena de ADN se logra mediante los desoxinucleótidos regulares (dNTP). Sin embargo, los ddNTP se agregan a la mezcla de reacción para terminar el crecimiento de la cadena. Estos ddNTPs están marcados con fluorescencia. Los cuatro tipos de ddNTP se agregan a cuatro mezclas de PCR separadas. Por lo tanto, se llevan a cabo cuatro reacciones de PCR separadas al agregar ddATP, ddGTP, ddCTP y ddTTP. En cada mezcla de reacción, el crecimiento de la cadena se termina en cada uno de los nucleótidos A, G, C y T respectivamente. Como ejemplo, en la mezcla de reacción con ddATP agregado, el crecimiento de diferentes amplicones se termina en cada nucleótido A en el fragmento de ADN. Luego, estas cuatro reacciones se separan mediante electroforesis en gel, y se utiliza un fluorómetro para buscar la fluorescencia separada. La secuenciación de Sanger se utiliza ampliamente para determinar la secuencia de los fragmentos utilizados en la clonación de ADN y los fragmentos amplificados por PCR. Las secuencias de nucleótidos determinadas se muestran en Figura 1.

Figura 1: Secuencias de ADN

Secuenciación de próxima generación

Las tecnologías de secuenciación de ADN más recientes se conocen colectivamente como secuenciación de próxima generación. Las reacciones de secuenciación se realizan a microescala en un chip a la vez. Por lo tanto, varias reacciones de secuenciación se realizan en paralelo. En la secuenciación de la próxima generación, la electroforesis capilar se utiliza además de la electroforesis en gel para la separación de amlicones con diversas longitudes creadas por el método de terminación de cadena. La electroforesis capilar es un método de separación analítica por el cual las moléculas se separan según su movilidad electroforética.

¿Cómo ayudan los fabricantes de fluorescentes a determinar una secuencia de nucleótidos?

Durante la secuenciación, el ADN a secuenciar sirve como la hebra de la plantilla para la síntesis de ADN por PCR. Se utiliza un cebador de ADN para el inicio de la síntesis de ADN por la ADN polimerasa. Una mezcla de cuatro bases regulares (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) y un bajo nivel de uno de los cuatro dideoxinucleótidos (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP, y ddTTP) se agregan como componentes de la reacción de PCR. Por lo tanto, cuatro, las reacciones de PCR individuales se realizan mediante la adición de cada uno de los cuatro ddNTPs. Los didesoxinucleótidos poseen dos características especiales:

1. Carecen del grupo 3'-OH al que la ADN polimerasa agrega el nucleótido entrante. Por lo tanto, la incorporación del ddNTP termina el crecimiento de la cadena..
2. Están etiquetados con diferentes tintes fluorescentes: los ddATP está marcado con un tinte verde, la ddGTP está marcado con un tinte amarillo, la ddCTP está etiquetado con azul, y el ddTTP está marcado con tinte rojo.

Sin embargo, los ddNTP que terminan la cadena se agregan en bajas concentraciones; no terminan todo el proceso de PCR a la vez. Pero, cuando uno de los cuatro ddNTPs se incorpora a la cadena en crecimiento, esa cadena particular se termina. Por lo tanto, al final de cada cuatro reacciones de PCR, se producen una serie de amplicones (los fragmentos de ADN resultantes por PCR), que se terminan en cada nucleótido del fragmento de ADN diana. Estos amplicones se pueden ejecutar en un gel. Los colorantes fluorescentes que pasan en un punto definido del gel electroforético se pueden escanear con un fluorómetro para determinar la secuencia de nucleótidos en los secuenciadores automáticos de ADN.. La secuencia de nucleótidos marcada con fluorescencia obtenida en la secuenciación del ADN se muestra en Figura 2.

Figura 2: Secuencia de nucleótidos marcados por fluorescencia

Al combinar cada uno de los nucleótidos de la serie, se puede determinar la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN inicial. La secuencia de nucleótidos de un fragmento con 750-1,000 pares de bases se puede determinar fácilmente por secuencia mediante la secuenciación de Sanger. Sin embargo, la secuenciación de un genoma completo sigue siendo desafiante debido a la presencia de un gran número de nucleótidos. La secuenciación 454 es un tipo de secuenciación de próxima generación por la que se pueden leer 20 millones de pares de bases por ejecución individual.

Conclusión

La secuenciación es una técnica utilizada en la determinación de la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN particular. La secuenciación de Sanger y la secuenciación de próxima generación son las dos tecnologías principales de secuenciación. Ambas tecnologías utilizan marcadores fluorescentes para la determinación de la secuencia de nucleótidos. Cada uno de los cuatro dideoxinucleótidos con terminación de cadena está marcado con cuatro colorantes fluorescentes diferentes, y se utilizan en cuatro reacciones de PCR separadas para obtener la secuencia.

Referencia:

1. Adams, Jill U. “DNA Sequencing Technologies”. Nature News, Nature Publishing Group, disponible aquí.
2. Carr, Steven M. Secuenciación fluorescente, disponible aquí.
3. "Secuenciación de ADN - Secuenciación automatizada con tintes fluorescentes". Artículos de JRank, disponibles aquí.

Imagen de cortesía:

1. “Alineando secuencias (2)” por Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) a través de Flickr
2. “Radioq Fluorescente Fluorescente” Por Abizar en Wikipedia en inglés (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia