Cómo aislar el ARNm del ARN total

Las combinaciones de oligo-dT / portador se utilizan principalmente en la purificación de ARNm a partir de ARN total mediante una técnica conocida como cromatografía de afinidad. Hay dos métodos principales para aislar el ARNm del ARN total en función del tipo de células; A saber, método directo de aislamiento de ARNm y método negativo de aislamiento de ARNm. Ambos métodos se explican en este artículo..

El ARN mensajero (ARNm) es un producto de la transcripción, que se compone de una serie de nucleótidos de ARN. Transporta información en los genes desde el núcleo hasta el citoplasma para la síntesis de proteínas. El aislamiento de ARN a partir de una línea celular particular da como resultado un ARN total, que consiste en ARNr y ARNt junto con ARNm. Por lo tanto, el ARNm debe separarse de la mezcla de ARN total durante el estudio del transcriptoma de la línea celular. Para la separación se utilizan propiedades únicas de ARNm, como la presencia de una cola poli (A) en el extremo 3 'de la molécula de ARNm. Dado que las moléculas de oligo-dT son complementarias de la cola poli (A), el ARNm se puede aislar de una mezcla de ARN total.

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es el ARNm?
     - Definición, Estructura, Función
2. ¿Cuál es la composición del ARN total?
    - ARNm, ARNr, ARNt
3. Cómo aislar el ARNm del ARN total
    - Uso de Oligo-dT / Carrier Molecules

Términos clave: Cromatografía de afinidad, ARN mensajero (ARNm), método Minus, oligo dT, cola Poly (A), ARN total

¿Qué es el ARNm?

El ARNm es una transcripción de un gen codificador de proteínas. Se produce dentro del núcleo en eucariotas y transporta información para la producción de una proteína particular en el citoplasma. Se traduce en una secuencia de aminoácidos de la proteína durante la traducción, asistida por los ribosomas. La transcripción primaria producida por la transcripción de eucariotas se llama pre-mRNA.

Figura 1: Estructura del ARNm

Durante las modificaciones post-transcripcionales, se produce una molécula de ARNm madura con varias características, como la tapa 5 'y la cola de poli (A). El ARNm total de un organismo particular se conoce como su transcriptoma.

¿Cuál es la composición del ARN total?

El resultado del aislamiento del ARN se llama ARN total. Está compuesto por los tres tipos principales de ARN producidos por una célula. Son ARNm, ARNt y ARNr. Tanto el ARNt como el ARNr ayudan en la traducción. El tamaño del ARNm eucariótico es de 0.5-20 kb. Transferencia de ARN (ARNt) trae aminoácidos correspondientes durante la traducción. Tiene una longitud de 76-90 pares de bases y está compuesta por una región anticodóntica, que es complementaria a un codón particular en el ARNm. El ARN ribosomal (ARNr) es un componente de los ribosomas. Algunos de los ARNr humanos tienen 5 kb de largo.

Más del 90% del ARN total está compuesto de ARNt y ARNr. Solo el 1-5% del ARN total es ARNm. Una célula de mamífero típica puede consistir en aproximadamente 500,000 moléculas de ARNm por célula. La cantidad de un tipo particular de ARNm puede ser de 15-20,000 copias por célula.

Cómo aislar el ARNm del ARN total

Una serie de técnicas de biología molecular, como la construcción de la biblioteca de cDNA, la preparación de muestras para la preparación de micromatrices, el análisis de transferencia Northern para los genes expresados ​​débilmente, etc. requieren un mRNA de alta calidad. Hay dos métodos principales para aislar el ARNm del ARN total según el tipo de células: el método directo de aislamiento del ARNm y el método negativo del aislamiento del ARNm.

Método directo de aislamiento de ARNm

El principio de la separación del ARNm maduro del ARN total eucariota implica la selección por afinidad / cromatografía de afinidad del ARNm poliadenilado con el uso de oligo dT (oligodesoximidilato), que es complementario de la cola de poli (A). Esto es posible por la ausencia de una cola poli (A) en los otros dos tipos de ARN: ARNt y ARNr. 

El ARNm consta de 30-200 nucleótidos de adenina en su cola de poli (A). Las columnas de afinidad rellenas con oligo dT / combinación portadora se utilizan en el aislamiento de ARNm del ARN total. La combinación de oligo dT / vehículo puede ser oligo dT unido a celulosa, oligo dT biotinilado con perlas magnéticas acopladas a estreptavidina o perlas de poliestireno-látex acopladas a oligo dT. Todas las condiciones experimentales deben estar en condiciones libres de ARNasa para prevenir la descomposición enzimática del ARN.

Figura 2: Cromatografía de afinidad.

El ARN total se debe disolver en un tampón con alto contenido de sal y calentar brevemente a 65-70 ° C para romper las estructuras secundarias del ARN. Las condiciones para el aislamiento del ARN varían entre los kits disponibles comercialmente para el aislamiento del ARNm. Sin embargo, la preparación de poli (A) -RNA o mRNA se compone de tres pasos.

1. Hibridación de poli (A) -RNA a oligo dT moléculas conectadas a un portador
2. Lavado de ARN no unido
3. Elución de poli (A) -RNA de la combinación oligo-dT / portador en condiciones de baja rigurosidad

Método menos de aislamiento de ARNm

La purificación de ARNm basada en Oligo dT solo produce ARNm con una cola poli (A) o ARNm eucariótico maduro. Por lo tanto, otro método conocido como método negativo se puede usar en la purificación de ARNm que no tiene una cola de poli (A). Este método se puede utilizar en el aislamiento de ARNm de levadura y ARN total bacteriano. También se puede usar en el aislamiento de un tipo inmaduro de ARNm junto con el ARNm maduro de células eucariotas. Implica el enriquecimiento del transcriptoma al eliminar el ARN ribosomal grande del ARN total. El RiboMinus^TM El kit de aislamiento Transcriptome de ThermoFisher Scientific utiliza tres pasos para la purificación eficiente del ARNm de la levadura y el ARN bacteriano total.

1. Hibridación del ARN total con sondas de oligonucleótidos 5 'marcadas con biotina específicas de secuencia de ARNr
2. Eliminación del complejo de sonda marcado con rRNA / 5'-biotina junto con las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina
3. Purificación de impurezas y elución de ARNm..

Conclusión

El ARN total se compone de los tres tipos principales de ARN: ARNm, ARNr y ARNt. La purificación del ARNm a partir del ARN total es esencial para el análisis del transcriptoma de un organismo particular. Los métodos de purificación se basan en el tipo de ARNm. El ARNm eucariótico, que contiene una cola poli (A), puede aislarse mediante cromatografía de afinidad con oligo dT. El ARNm eucariótico inmaduro y el ARNm de células bacterianas y de levadura pueden aislarse agotando el ARNr grande del ARN total.

Referencia:

1. "Extracción de ARNm". Thermo Fisher Scientific, disponible aquí.
2. "Extracción de ARN por tipo de ARN". Thermo Fisher Scientific, disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. "ARNm maduro" (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. "Afinidad" Por Jamit en Wikilibros en inglés - Transferido de en.wikibooks a Commons por Adrignola usando CommonsHelper (Dominio público) a través de Commons Wikimedia