¿Cómo funciona la secuenciación de Illumina?

La secuenciación de Illumina es un método de secuenciación de próxima generación, que también se denomina "secuenciación por síntesis"Método. La secuenciación de Illumina está involucrada en el procesamiento de millones de fragmentos en paralelo. Los cuatro pasos básicos involucrados en el flujo de trabajo de secuenciación de Illumina son la preparación de la biblioteca, la generación de agrupaciones, la secuenciación y el análisis de datos, que se describen con más detalle en este artículo..

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es la secuenciación de Illumina?
     - Definición, Hechos, Ventajas.
2. ¿Cómo funciona la secuenciación de Illumina?
     - Proceso de secuenciación de Illumina:
          - Preparación de la biblioteca
          - Generación de cluster
          - Secuenciación
          - Análisis de los datos

Términos clave: Generación de conglomerados, análisis de datos, secuenciación de Illumina, preparación de bibliotecas, secuenciación por síntesis

¿Qué es la secuenciación de Illumina?

La tecnología de secuenciación o secuenciación por síntesis (SBS) de Illumina es la tecnología de secuenciación de última generación más utilizada en el mundo. Más del 90% de los datos de secuenciación del mundo son generados por la secuenciación de Illumina. Fue desarrollado originalmente por Shankar Balasubramanian y David Klenerman en la Universidad de Cambridge. Fundaron una compañía conocida como Solexa en 1998. Luego, Illumina compró Solexa en 2007, mejorando rápidamente la tecnología original. Por lo tanto, el método también se llama Método de secuenciación de Solexa / Illumina.. La principal ventaja de la secuenciación de Illumina es que ofrece un alto rendimiento de lecturas sin errores..

¿Cómo funciona la secuenciación de Illumina?

Los cuatro pasos involucrados en la secuenciación de Illumina se describen a continuación..

Paso 1. Preparación de la biblioteca

• Se prepara una biblioteca de secuenciación por simultáneo. etiquetación del ADN en segmentos cortos de 200-600 pares de bases por transposasas en un proceso conocido como etiquetación, seguido de la ligadura del adaptador en los extremos 3 'y 5' de los segmentos cortos de ADN.
• Motivos adicionales como el sitio de unión del cebador de secuenciación, el índice y una región, que es complementaria al oligo celular de flujo, se agregan al adaptador en ambos lados mediante amplificación de ciclo reducido. La etiqueta y la adición de motivos se muestran en Figura 1.

Figura 1: Etiquetado y adición de motivos

Paso 2. Generación de cluster

• La biblioteca de secuenciación preparada se desnaturaliza y se carga en una celda de flujo Para la generación de cluster. Durante la generación del cluster, cada fragmento en la biblioteca de secuenciación se amplifica isotérmicamente. La celda de flujo está formada por vidrio que contiene carriles. Cada carril está recubierto con dos tipos de oligonucleótidos. Un tipo es complementario a la región 5 'de los motivos adicionales y el otro tipo es complementario a la región 3' de los motivos adicionales de la biblioteca preparada. Por lo tanto, estos oligos se unen a las regiones correspondientes de ADN en la biblioteca de secuenciación. La celda de flujo con dos tipos de oligos se muestra en Figura 2. El oligo que se une a la región 5 'de la biblioteca de secuenciación es de color rosa, mientras que el oligo que se une a la región 3' de la biblioteca de secuenciación es de color verde.

Figura 2: Célula de flujo

• Una vez que la biblioteca de secuenciación monocatenaria se une al oligo, la cadena complementaria se genera mediante la ADN polimerasa. Luego, el ADN de doble cadena resultante se desnaturaliza y la cadena original se elimina por lavado.
• los amplificación clonal del fragmento se logra a través de amplificación de puente. Durante este proceso, la hebra se pliega sobre el segundo tipo de oligo en la celda de flujo. Luego, la polimerasa sintetiza el puente de doble cadena. La desnaturalización del puente da como resultado dos cadenas de ADN: tanto la cadena directa como la inversa en los oligos de la célula de flujo.
• La amplificación del puente se repite una y otra vez para obtener simultáneamente millones de agrupaciones de todos los tipos de fragmentos en la biblioteca de secuenciación mediante amplificación clonal. La amplificación clonal se muestra en figura 3.

Figura 3: Amplificación Clonal

• Luego, las hebras inversas se lavan y retienen solo las hebras delanteras en la celda de flujo. En la cadena delantera, el extremo 3 'está libre y está bloqueado para evitar un cebado no deseado.

Paso 3. Secuenciación

Primera lectura de la secuencia inversa

• La secuenciación comienza con el extensión del primer cebador de secuenciación. El método de secuenciación de Illumina utiliza dNTP modificados, que contienen un terminador en la posición 3 'del azúcar desoxirribosa. Estos dNTP también están marcados con fluorescencia en diferentes colores.

• Después de la adición de cada nucleótido complementario, se observan los grupos en la celda de flujo para la emisión de fluorescencia..

• Después de la detección de la luz, el fluoróforo se puede lavar..

• Luego, el grupo terminador de la posición 3 'del azúcar se regenera por un grupo hidroxilo, permitiendo la adición de un segundo dNTP a la cadena en crecimiento. Este proceso se conoce como secuenciación por síntesis. La secuenciación por síntesis se muestra en Figura 4.

Figura 4: Secuenciación por Síntesis

• Al término de la síntesis, el primera lectura de la secuencia inversa Se obtiene y se lava el producto de secuenciación..

Índice 1 Lectura

• El cebador del índice 1 luego se hibrida a grupos para generar una segunda lectura de la misma manera por secuenciación por síntesis. El producto de secuenciación es lavado.

Índice 2 de lectura

• El extremo 3 'del grupo se desprotege, lo que permite la hibridación del extremo 3' con el segundo tipo de oligo en la celda de flujo (color verde). Por esto, se obtiene la secuencia de la región del índice 2. El producto de secuenciación es lavado.

Segunda lectura de la secuencia directa

• El segundo tipo de oligo se extiende por una polimerasa, formando un puente de doble cadena. El puente está desnaturalizado y sus extremos 3 'están bloqueados. La hebra delantera se lava.
• los segunda lectura de la secuencia hacia adelante se obtiene mediante secuenciación por síntesis mediante la hibridación y extensión del segundo cebador de secuenciación.

Paso 4. Análisis de datos

• Los miles de millones de lecturas obtenidas por secuenciación se agrupan en función de sus secuencias de índice..
• Luego, las secuencias con lecturas similares se agrupan.
• Las lecturas hacia adelante y hacia atrás se emparejan para formar secuencias contiguas.
• Las alineaciones ambiguas se pueden resolver por secuencias pareadas..
• Las secuencias contiguas se alinean con el genoma de referencia para la identificación de la variante.

El siguiente video explica el proceso completo de secuenciación de Illumina..

Conclusión

La secuenciación de Illumina es un método de secuenciación de próxima generación. La secuenciación de Illumina está involucrada en la preparación de una biblioteca de secuenciación con fragmentos largos de ADN de 200-600 pares de bases. Los cuatro pasos involucrados en la secuenciación de Illumina son la preparación de la biblioteca, la generación de agrupaciones, la secuenciación y el análisis de datos. Dado que la secuenciación de Illumina proporciona lecturas de secuencia con alta precisión, es el método de secuenciación más utilizado en el mundo..

Referencia:

1. "Secuenciación por tecnología de síntesis (SBS)". Tecnología de secuenciación | Secuenciación por síntesis, Disponible aquí.

Imagen de cortesía:

1. “Preparación de procesamiento de ADN” por DMLapato - Trabajo propio (CC BY-SA 4.0) a través de Commons Wikimedia
2. "Cadenas de oligonucleótidos en la celda de flujo" Por DMLapato - Trabajo propio, (CC BY-SA 4.0) a través de Commons Wikimedia
3. "Secuenciación por síntesis Terminadores reversibles" Por Abizar Lakdawalla (charla) - Creé este trabajo completamente por mí mismo (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
4. “Generación de clúster” por DMLapato - Trabajo propio (CC BY-SA 4.0) a través de Commons Wikimedia