Diferencia entre la fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba

los diferencia principal entre la fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba es que la La cromatografía de fase inversa (RPC) utiliza un medio más hidrófobo, lo que conduce a interacciones más fuertes, mientras que la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) utiliza un medio menos hidrófobo en comparación con el medio en la cromatografía de fase inversa.  

La cromatografía de fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba son dos técnicas cromatográficas que dependen de las interacciones entre las superficies hidrófobas de un medio de cromatografía y los parches hidrófobos en la superficie de las biomoléculas..

Áreas clave cubiertas

1. ¿Qué es la cromatografía de fase inversa?
     - Definición, Pasos, Aplicaciones
2. ¿Qué es la cromatografía de interacción hidrófoba?
     - Definición, Pasos, Aplicaciones
3. ¿Cuáles son las similitudes entre la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba?
     - Esquema de características comunes
4. ¿Cuál es la diferencia entre la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba?
     - Comparación de diferencias clave

Términos clave

Cromatografía de interacción hidrófoba, HIC, Media, Cromatografía de fase inversa, RPC

¿Qué es la cromatografía de fase inversa?

La cromatografía de fase inversa (RPC) es una técnica cromatográfica utilizada en la purificación y análisis de biomoléculas como proteínas, péptidos y oligonucleótidos. Proporciona una separación de alta resolución y es ideal para el mapeo de péptidos y la verificación de pureza. El RPC se usa más a menudo en el pulido final de péptidos y oligonucleótidos.

Se pueden usar dos tipos principales de medios hidrófobos como la fase estacionaria: perlas de sílice cubiertas con cadenas de carbono o polímeros hidrófobos desnudos. Se llena una columna con el medio hidrófobo en forma de lecho empacado sobre el que se aplica la muestra. Un agente de emparejamiento de iones como el ácido trifluoroacético (TFA) se puede agregar a la fase móvil para mejorar la formación de interacciones hidrófobas. Al principio se usa un modificador orgánico tal como 5% de acetonitrilo y la elución se puede iniciar aumentando el% de acetonitrilo..

Figura 1: Teoría de la cromatografía de fase inversa

Las biomoléculas que son menos hidrófobas / más polares se eluirán primero, mientras que las moléculas más hidrófobas se eluirán más adelante. RPC es la técnica cromatográfica con mayor resolución..

¿Qué es la cromatografía de interacción hidrófoba?

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) es la otra técnica utilizada en la separación de biomoléculas en función de la hidrofobicidad en condiciones moderadas. Es una técnica ideal para la purificación de proteínas cuando las muestras deben someterse a precipitación con sulfato de amonio en la concentración y limpieza inicial de la muestra. El nivel elevado de sal durante la precipitación con sulfato de amonio aumenta la interacción entre los componentes hidrófobos.

Figura 2: Efecto de la alta concentración de sal en las interacciones hidrófobas

El medio hidrófobo de HIC consiste en una matriz inerte de partículas esféricas recubiertas con ligandos que contienen grupos alquilo o arilo. Las interacciones hidrófobas ocurren bajo concentraciones de sal moderadamente altas (típicamente 1-2 M sulfato de amonio o 3 M NaCl). El tampón de inicio asegura la unión de las proteínas de interés al medio mientras se eliminan las impurezas. El tampón de elución contiene baja concentración de sal, lo que debilita la interacción entre las proteínas y la fase estacionaria..

Similitudes entre la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba

• La cromatografía de fase inversa e interacción hidrófoba son dos técnicas utilizadas en la separación de biomoléculas en función de su hidrofobicidad..
• La fase móvil de ambas técnicas es agua o un disolvente orgánico..
• Utilizan columnas de lecho empacado..
• El buffer de inicio asegura la unión de las moléculas deseadas a la columna.
• Las moléculas con la menor hidrofobicidad pueden eluir primero, mientras que las moléculas más hidrófobas pueden eluir más tarde.
• El paso final de lavado eluye las moléculas más fuertemente unidas.
• La resolución de ambas técnicas es una combinación de la selectividad (grado de separación entre los picos), la eficiencia (la capacidad de producir picos estrechos y simétricos) de la técnica, la masa de la muestra y el tiempo de retención..

Diferencia entre la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de interacción hidrófoba

Definición

La cromatografía de fase inversa (RPC) se refiere a la técnica de separación de mayor resolución basada en la hidrofobicidad de las moléculas en una mezcla, mientras que la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) se refiere a un tipo de técnica de separación basada en la hidrofobicidad, pero funciona en condiciones relativamente suaves.

Hidrofobicidad

El RPC funciona en condiciones más hidrófobas, mientras que el HIC funciona en condiciones hidrófobas relativamente suaves.

Interacciones

La cromatografía de fase inversa conduce a interacciones más fuertes entre las moléculas y la fase estacionaria que tiene que revertirse durante la elución por un modificador orgánico, mientras que HIC conduce a interacciones moderadamente altas entre la fase estacionaria y las moléculas..

Medios hidrofóbicos

RPC usa perlas de sílice cubiertas con cadenas de carbono o polímeros hidrófobos desnudos, mientras que HIC usa una matriz inerte de partículas esféricas recubiertas con ligandos que contienen grupos alquilo o arilo.

Iniciar Buffer

El buffer de inicio en RPC usa ácido trifluoroacético (TFA), mientras que el buffer de inicio de HIC usa concentraciones de sal moderadamente altas.

Elución

El aumento del porcentaje de acetonitrilo comienza la elución en RPC, mientras que la concentración de sal decreciente comienza la elución en HIC..  

Resolución

La cromatografía de fase inversa es la técnica cromatográfica con la resolución más alta, mientras que la resolución de HIC es baja en comparación con RPC.

Aplicaciones

RPC se utiliza en la separación de proteínas, péptidos y oligonucleótidos, mientras que HIC se utiliza principalmente en la purificación de proteínas.

Conclusión

La cromatografía de fase inversa es la técnica cromatográfica con la resolución más alta, que funciona en condiciones altamente hidrófobas. Pero, HIC opera bajo condiciones hidrofóbicas moderadas. RPC y HIC son los dos tipos de técnicas de separación basadas en la hidrofobicidad. La principal diferencia entre RPC y HIC es el grado de hidrofobicidad utilizado en cada técnica..

Referencia:

1. Interacción hidrófoba y cromatografía de fase invertida: principios y métodos. GE Healthcare, 2006. Disponible aquí

Imagen de cortesía:

1. “Esquema de elución en gradiente de fase inversa” por Nategm - Trabajo propio (CC BY-SA 4.0) a través de Commons Wikimedia   
2. "Hicsalt" Por Daliak en Wikilibros en inglés - Transferido de en.wikibooks a Commons. (Dominio público) a través de Commons Wikimedia