Diferencia entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación

Diferencia clave: secuenciación de Sanger y pirosecuenciación
 

La secuenciación del ADN es muy importante para el análisis del ADN, ya que el conocimiento de la disposición correcta de los nucleótidos en una región particular del ADN revela mucha información importante al respecto. Existen diferentes métodos de secuenciación del ADN. La secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación son dos métodos diferentes de secuenciación de ADN ampliamente utilizados en Biología Molecular. La diferencia clave entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación es que La secuenciación de Sanger utiliza dideoxinucleótidos para terminar la síntesis de ADN para leer la secuencia de nucleótidos, mientras que la pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato incorporando los nucleótidos y sintetizando la secuencia complementaria para leer el orden exacto de la secuencia.

CONTENIDO
1. Resumen y diferencia clave
2. ¿Qué es la secuenciación de Sanger?
3. ¿Qué es la pirosecuenciación?
4. Comparación lado a lado: secuenciación de Sanger y pirosecuenciación
5. Resumen

¿Qué es la secuenciación de Sanger??

La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN de primera generación desarrollado por Frederick Sanger y sus colegios en 1977. También se conoce como Secuenciación de la terminación de la cadena o Secuenciación Dideoxy ya que se basa en la terminación de la cadena por dideoxinucleótidos (ddNTPs). Este método se utilizó ampliamente durante más de 30 años hasta que se desarrolló la Secuenciación de Nueva Generación (NGS). La técnica de secuenciación de Sanger permitió el descubrimiento del orden correcto de nucleótidos o la unión de un fragmento de ADN particular. Se basa en la incorporación selectiva de ddNTPs y la terminación de la síntesis de ADN durante el in vitro La replicación del ADN. La ausencia de grupos 3 'OH para continuar la formación del enlace fosfodiéster entre nucleótidos adyacentes es una característica única de los ddNTP. Por lo tanto, una vez que se adjunta el ddNTP, el alargamiento de la cadena cesa y termina desde ese punto. Hay cuatro ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP) utilizados en la secuenciación de Sanger. Estos nucleótidos detienen el proceso de replicación del ADN cuando se incorporan a la cadena de ADN en crecimiento y dan como resultado longitudes variables de ADN corto. La electroforesis en gel capilar se utiliza para organizar estas cadenas cortas de ADN según su tamaño en un gel, como se muestra en la Figura 01.

Figura 1: electroforesis en gel capilar de ADN corto sintetizado

por in vitro replicación del ADN, deben proporcionarse algunos requisitos. Son la enzima ADN polimerasa, el ADN plantilla, los cebadores oligonucleotídicos y los desoxinucleótidos (dNTP). En la secuenciación de Sanger, la replicación del ADN se realiza en cuatro tubos de ensayo separados junto con cuatro tipos de ddNTP por separado. Los desoxinucleótidos no están totalmente reemplazados por los respectivos ddNTP. Se incluye una mezcla del dNTP particular (por ejemplo, dATP + ddATP) en el tubo y se replica. Cuatro productos de tubos separados se ejecutan en un gel en cuatro pozos separados. Luego, al leer el gel, la secuencia se puede construir como se muestra en la Figura 02.

Figura 02: Secuenciación de Sanger

La secuenciación de Sanger es una técnica importante que ayuda en muchas áreas de la biología molecular. El proyecto del genoma humano se completó con éxito con la ayuda de los métodos basados ​​en la secuenciación de Sanger. La secuenciación de Sanger también es útil en la secuenciación de ADN, investigación de enfermedades genéticas y de cáncer, análisis de expresión génica, identificación humana, detección de patógenos, secuenciación microbiana, etc..

Hay varias desventajas de la secuenciación de Sanger:

• La longitud del ADN que se está secuenciando no puede superar los 1000 pares de bases.
• Solo se puede secuenciar una hebra a la vez.
• El proceso es lento y costoso..

Por lo tanto, se desarrollaron nuevas técnicas avanzadas de secuenciación con el tiempo para superar estos problemas. Sin embargo, la secuenciación de Sanger todavía está en uso debido a sus resultados altamente precisos hasta aproximadamente 850 fragmentos de longitud de pares de bases.

¿Qué es la pirosecuenciación??

Pyrosequencing es una nueva técnica de secuenciación de ADN basada en la "secuenciación por síntesis". Esta técnica se basa en la detección de la liberación de pirofosfato en la incorporación de nucleótidos. El proceso es empleado por cuatro enzimas diferentes: ADN polimérico, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa y dos sustratos de adenosina 5 'fosfosulfato (APS) y luciferina..

El proceso comienza con la unión del cebador con la plantilla de ADN de una sola hebra y la ADN polimerasa inicia la incorporación de nucleótidos complementarios a ella. Cuando los nucleótidos se unen (polimerización de ácido nucleico), libera grupos pirofosfato (dos grupos fosfato unidos) y energía. Cada adición de nucleótido libera una cantidad equimolar de pirofosfato. El pirofosfato se convierte en ATP por ATP sulfurylasa en presencia de sustrato APS. El ATP generado impulsa la conversión mediada por luciferasa de luciferina a oxiluciferina, produciendo luz visible en cantidades que son proporcionales a la cantidad de ATP. La luz es detectada por un dispositivo de detección de fotones o por un fotomultiplicador y crea un pirograma. Apyrase degrada el ATP y los dNTP no incorporados en la mezcla de reacción. La adición de dNTP se realiza de una en una. Dado que la adición de nucleótidos se conoce de acuerdo con la incorporación y detección de la luz, se puede determinar la secuencia de la plantilla. El pirograma se utiliza para generar la secuencia de nucleótidos del ADN de muestra como se muestra en la Figura 03.

La pirosecuenciación es muy importante en el análisis del polimorfismo de un solo nucleótido y en la secuenciación de tramos cortos de ADN. La alta precisión, flexibilidad, facilidad de automatización y procesamiento paralelo son las ventajas de la pirosecuenciación sobre las técnicas de secuenciación de Sanger..

Figura 03: Pirosecuenciación

¿Cuál es la diferencia entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación??

Secuenciación Sanger vs Pirosecuenciación
La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN basado en la incorporación selectiva de ddNTP por la ADN polimerasa y la terminación de la cadena..	La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN basado en la detección de la liberación de pirofosfato tras la incorporación de nucleótidos.
Uso de ddNTP
Los ddNTP se utilizan para terminar la replicación del ADN.	no se utilizan ddNTPs.
Enzimas involucradas
ADN polimerasa se utilizan.	Se utilizan cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurylasa, Luciferasa y Apyrase..
Sustratos utilizados
APS y luciferina no se utilizan.	Se utilizan adenosina 5 'fosfosulfato (APS) y luciferina.
Temperatura máxima
Este es un proceso lento.	Este es un proceso rápido..

Resumen - Secuenciación de Sanger vs Pirosecuenciación

La secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación son dos métodos de secuenciación de ADN utilizados en biología molecular. La secuenciación de Sanger construye el orden de los nucleótidos en secuencia al terminar el alargamiento de la cadena, mientras que la pirosecuenciación construye el orden preciso de los nucleótidos en secuencia al incorporar nucleótidos y detectar la liberación de pirofosfatos. Por lo tanto, la principal diferencia entre la secuenciación de Sanger y la pirosecuenciación es que la secuenciación de Sanger funciona en la secuenciación por terminación de la cadena, mientras que la pirosecuenciación funciona en la secuenciación por síntesis.

Referencia:
1. Fakruddin, Md, y Abhijit Chowdhury. “Pirosecuenciación: una alternativa a la secuenciación tradicional de Sanger”. Revista estadounidense de bioquímica y biotecnología. Publicaciones científicas, 02 de marzo de 2012. Web. 28 de febrero de 2017.
2. “Secuenciación de Sanger”. Secuenciación de Sanger - Temas de ScienceDirect. N.p., n.d. Web. 28 de febrero de 2017

Imagen de cortesía:
1. "Didesoxy-Methode" Por Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) vía Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Por Enzo en la lengua polaca Wikipedia (CC BY-SA 3.0) vía Commons Wikimedia
3. "Pirosecuenciación" por microbiología bytes. (CC BY-SA 2.0) vía Flickr